Práctica 2: Determinación cuantitativa de hemoglobina

Determinación cuantitativa de hemoglobina

Objetivo
Medir la absorbancia de la hemoglobina mezclado con un reactivo 

Fundamento
La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otrorga el color ojo a la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxígeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias. 
Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud. 

Materiales

• Puntas de pipetas desechables 

• Pipeta automática de 10 μL 

• Cubetas de espectofotometría de 1 cm 

• Pipetas graduadas y auxiliar de pipeteo

• Tubos de hemólisis

Reactivos 

• Hemoglobin 50x o también llamado Drabkin

Formado por ferricianuro de potasio, cianuro de potasio y dihidrogeno fosfato de potasio

• Hemoglobin CAL (patrón de hemoglobina)

• Agua destilada

Muestra 

• Sangre venosa con anticoagulante EDTA 

Aparataje y equipos 

• Espectofotómetro para lecturas a 540 nm 

Procedimiento 
Método micro
-Encendemos el espectofotómetro
- Comenzamos preparando los reactivos. Primero preparamos el reactivo RT. 
El grupo 1 se encargará de preparar el reactivo RT que servirá para la muestra, el blanco y el patrón. 
Para ello calcularemos cuanta agua destilada y hemoglobin 50x necesitaremos. Debemos tener en cuenta que utilizaremos el reactivo RT para la muestra (2,5 mL), el blanco (2,5 mL) y el patrón (2,5 mL). 
No vamos a utilizar las medidas que vienen en el protocolo, sino que para no excedernos de cantidad lo que haremos será calcular las medidas para las cinco mesas. 

- Solo utilizaremos un patrón y un blanco para toda la clase, así que el grupo 1 los hará y los depositará en una cubeta de espectofotometría de 1 cm. El blanco está formado por 2,5 mL de RT y el patrón está formado por 2,5 mL de RT y 10 microlitos de calibrador. 

- Cuando tengan el reactivo RT, lo repartirán por las mesas en tubos de hemólisis. Nos darán 2,5 mL de RT. 

-Cuando tengamos todo preparamos la muestra con sangre venosa. 
Antes de mezclar nada, debemos homogeneizar la sangre ya que ha estado un tiempo en el frigorífico. 
Una vez todo listo, añadimos 10 microlitros de sangre venosa al tubo que contenía el RT y mezclamos invirtiéndolo. 
Después lo dejamos 3 minutos a Tª ambiente (15-20ºC)
*Si no hubiera la Tª ambiente correcta, debemos encender el baño maría y calentar ahí la muestra.

- Depositamos la muestra en la cubeta de espectofotometría y vamos a medir la absorbancia. 
Primero metemos el blanco, después el patrón y por último la muestra. 

Resultados y observaciones 

• Blanco- 0,000 A
• Patrón- 1,032 A
• Muestra- 0,442 A

Si utilizamos la fórmula para saber cuál es la concentración de nuestra muestra, nos da lo siguiente: 

Nos da un resultado de 6,42 g/dL, que no entra en los valores de referencia ni de hombres ni mujeres. Todo esto puede tener varias razones: 

- La muestra es de un lactante

- La muestra y los reactivos han estado en el frigorífico por mas de seis meses

Errores y fallos 
Algunos errores o fallos pueden ser: 
- El tiempo que lleva la sangre en el frigorífico 
- No sabemos si la muestra es de hombre, mujer o lactante