Práctica 20: Determinación cuantitativa de hierro

Determinación cuantitativa de hierro

Objetivo

El objetivo de la práctica es determinar la concentración de hierro que hay en el sobrenadante de la práctica anterior

Fundamento

El hierro se disocia del complejo sérico hierro-transferrina en medio ácido débil. El hierro libre se reduce a  ión ferroso mediante el ácido ascórbico. Los iones ferrosos en presencia de FerroZine forma un complejo coloreado. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hierro en la muestra ensayada.

Significado clínico

el hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado. El hierro es necesario para la producción de Hb, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los glóbulos rojos. Su déficit causa anemia ferropénica. Se encuentra niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina. La variación día a día es común en poblaciones sanas. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Materiales

• Tubos de hemólisis de 3 mL

• Micropipetas automáticas

• Puntas de pipeta desechables

Muestra

• Sobrenadante de la práctica anterior (CFTH)

Reactivos

• R1- Tampón
• R2- Reductor
• R3- Color
• IRON CAL

Aparataje

• Espectofotómetro

Procedimiento

- Preparación de los reactivos

1. Disolvemos el contenido completo de R2 en un frasco de R1

2. Tapamos y mezclamos hasta disolver su contenido

- Técnica

1. Cogemos 4 tubos y los etiquetamos: Blanco reactivo, Patrón, Blanco muestra y muestra

2. Depositamos en cada tubo:

- Blanco reactivo: 1 mL de RT + 1 gota de R3 + 200 microlitros de agua destilada

- Patrón: 1 mL de RT + 1 gota de R3 + 200 microlitros de patrón

- Blanco muesta: 1 mL de RT + 200 microlitros de muestra

- Muestra: 1 mL de RT + 1 gota de R3 + 200 microlitros de muestra

3. Mezclamos e incubamos 10 minutos a Tª ambiente

4. Leemos en el espectofotómetro

Lectura y resultados

Absorbancia.

- Blanco reactivo: 0,000

- Patrón: 0,086

- Blanco muestra: 0,000

- Muestra: 0,094

Cálculos:

(A) Muesta - (A) Blanco muestra - (A) Blanco reactivo / (A) Patrón - (A) Blanco reactivo x 100 (concetración patrón)

0,094 / 0,086 x 100 = 115,12 microgramos/dL hierro

Práctica 19: Precipitante de capacidad de fijación total del hierro

Precipitante de capacidad de fijación total del hierro (CFTH)

Objetivo

El objetivo de la práctica es determinar la capacidad de fijación total de hierro 

Fundamento

La trasnferrina sérica se satura con un exceso de Fe3+ y el exceso no fijado se elimina por precipitación con carbonato magnésico, determinándose a continuación la cantidad total de hierro presente. La diferencia entre la capacidad de fijación total de hierro hallada (CFTH) y el hierro sérico inicial (Hb) nos da la capacidad de fijación de hierro no saturado o residual.

Significado clínico

El hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La miglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado. El hierro es necesario para la producción de Hb, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los glóbulos rojos. 

El hierro se controla, normalmente, junto con la capacidad de fijación total del hierro (CFTH), y nos indica la capacidad de unión sérica disponible.

Encontramos niveles altos de CFTH en la anemia ferropénica. Niveles bajos en hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Materiales

• Tubos de hemólisis de 3 mL 

• Pipetas automáticas

• Puntas de pipetas desechables

Muestra 

• Suero o plasma heparinizado

Reactivo

• R5- solución de hierro

• R6- magnesio carabonato

Aparataje

• Centrifuga

Procedimiento

1- Pipeteamos en el tubo 0,5 mL de muestra y 1 mL de solución R5

2- Mezclamos bien e incubamos 10 minutos a Tª ambiente

3- Añadimos 3 cucharadas de solución R6

4- Mezclamos e incubamos 10 minutos a Tª ambiente

5- Centrifugamos 15 minutos a 3000 rpm

6- Recogemos el sobrenadante y lo guardamos para usarlo de muestra para la determinación de hierro

Lectura y resultado

Hacemos los cálculos: 

CFTH= Concentración de hierro en el sobrenadante x 3 (Factor de dilución)

CFTH= 345,35

Práctica 18: Determinación del porcentaje de reticulocitos (RET)

Determinación del porcentaje de reticulocitos (RET)

Objetivo
El objetivo de la práctica es:
- Determinar el RET por un número determinado de hematíes
- Calcular el número de reticulocitos existentes por volumen de sangre
- Valorar el REt, el número absoluto de reticulocitos y de la actividad eritropoyética

Fundamento
Usaremos un colorante de azul cresil brillante para colorear los reticulocitos que tengamos en la sangre

Materiales

• Lancetas

• Portaobjetos

• Parafilm

• Tubos de hemólisis de 3 mL

Muestra

• Sangre anticoagulada

Reactivos

• Azul de cresil brillante

Procedimiento

1. Depositamos dentro de un tubo de hemólisis 3 gotas de la solución de azul de cresil brillante
2. Añadimos 3 gotas de sangre al tubo que contiene el colorante
3. Tapamos el tubo con parafilm 
4. Mezclamos para que los eritrocitos absorban bien el colorante
5. Dejamos en reposo durante 20 minutos a Tª ambiente
6. Pasados los 20 minutos, volvemos a homogeneizar
7. Destapamos el tubo y cogemos una gota de la muestra y la depositamos en el porta
8. Hacemos una extensión con la gota y la dejamos secar
9. Observamos al microscopio

Lectura y resultado

Práctica 17: Detección de la reacción de peroxidasa en leucocitos

Detección de la reacción de peroxidasa en leucocitos

Objetivo

El objetivo de la práctica es realizar un frotis sanguíneo, teñirlo y hacer un examen microscópico

Fundamento y significado clínico

La reacción de peroxidasa, en particular la reacción citoquímicamente significativa de mieloperoxidasa, sirve de indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. El grado de madurez de los granulocitos en maduración puede ser estimado esencialmente según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca.

Las peroxidasas son catalasas lisososomales que transfieren el hidrógeno desde un donador adecuado (anteriormente la bencidina cancerígena, aquí: 4-cloro-1-naftol) a un peróxido (aquí: perçoxido de hidrógeno). Entonces el donador 4-cloro-1-naftol se oxida y transforma en un colorante insoluble pardo negruzco, que puede utilizarse como indicador de la correspondiente actividad de peroxidasas.

Materiales

• Portaobjetos

• Lancetas

• Cubetas para la tinción

• Capilares no heparinizados

Muestra

• Sangre capilar no hemolizada

Reactivos

• R1: 4-cloro-1-naftol
• R2: Tris(hidroximetil) aminometano-HCl solución tampón
• R3: solución de peróxido de hidrógeno

• Solución de Mayer

Procedimiento

- Preparación de las muestras

1. Hacemos un frotis de sangre con ayuda de los portas y una lanceta
2. Secamos al aire durante 30 minutos
3. Fijamos con la mezcla fijadorea leucognost durante 3 minutos
4. Enjuagamos con agua corriente del grifo durante 10 segundos
5. Secamos al aire

- Preparación de los reactivos

1. Preparamos en un matraz la solución de tinción, en la que añadimos: 

- Contenido total del frasco de R1 y 15 mL de etanol y mezclamos muy bien

-Añadimos mientras seguimos revolviendo 45 mL de agua destilada

-Añadimos 10 gotas del R2

-Añadimos 2 gotas de R3

*La solución de tinción es utilizable durante 3 horas

- Técnica

1. Introducimos el frotis sanguíneo en la solución de tinción durante 10 minutos
2. Enjuagamos con agua destilada durante 10 segundos
3. Secamos al aire
4. Introducimos el porta en la contratinción con hemallumbre según Mayer durante 2 minutos
5. Enjuagamos con agua corriente del grifo durante 3-5 minutos
6. Secamos al aire
7. Observamos al microscopio

Lectura y resultado

Observación al microscopio: