Práctica 16:Identificación de la actividad de la fosfatasa alcalina en leucocitos

Identificación de la actividad de la fosfatasa alcalina en leucocitos

Objetivo

El objetivo de la práctica es teñir la preparación para realizar un examen microscópico

Fundamento y significado clínico

Para la delimitación citoquímica de una leucemia mieloica crónica (CML) de otras enfermedades del tipo de formas mielo-proliferativas, especialmente frente a la mielofibrosis y a la policitemia o, respectivamente, otros procesos inflamatorios o tumorosos, es adecuada la determinación de la actividad de la fosfotasa alcalina de leucocitaria. Además el índice de la fosfatasa alcalina leucocitaria representa un parámetro sencillo del transcurso en el caso de CML, que refleja diversas fases de actividad de la enfermedad hematológica.
La fosfatasa alcalina de leucocitaria cataliza la hidrolisis de ésteres fosfóricos en medio alcalino. El 1-naftol liberado a partir del fosfato 1-naftol se acopla con una sal de diazonio para dar un azocolorante pardo, que precipita en la célula de acuerdo con la localización y la actividad fosfatasa alcalina de la célula.

Materiales

• Portaobjetos

• Lancetas

• Cubetas para la tinción

• Capilares no heparinizados

Muestra

• Sangre capilar no heparinizada

Reactivos

• R1: Tris(hidroximetil)-aminometano

• R2: Fosfato de 1-naftilo sal sódico

• R3: Variamin sal azul B

• Colorante de Mayer

Procedimiento

- Preparación de las muestras

1. Preparamos los frotis sanguíneos con ayuda de los portas
2. Dejamos secar los frotis al aire durante 30 minutos
3. Fijamos los frotis con la mezcla fijadora leucognost durante 3 minutos
4. Enjuagamos con agua corriente del grifo durante 10 segundos
5. Secamos al aire

- Preparación de reactivos

1. Mezclamos 4 cucharadas de R1 con 100 mL de agua destilada y nos da la solución A
2. Mezclamos 15 mL de la solución A con el contenido completo del frasco del reactivo 2 y nos da la solución B
3. Mezclamos 45 mL de la solución A con el contenido completo del frasco del reactivo 3  y nos da la solución C. 
4. Filtramos la solución C y la mezclamos con los 15 mL de la solución B y finalmente nos da la solución de tinción

*La solución solo es utilizable durante 90 minutos

- Técnica

1. Introducimos el portaobjetos con el frotis fijado en la solución de tinción durante 30 minutos
2. Introducimos el porta en agua destilada durante 5 minutos
3. Introducimos el porta en la cubeta con la contratinción con hemalumbre en solución según Mayer durante 5 minutos
4. Enjuagamos con agua corriente del grifo durante 5 minutos
5. Secamos al aire 
6. Observamos al microscopio

Lectura y resultado

Observación al microscopio: